Otimização de máquinas convenientes de PCR em tempo real

Se for PCR quantitativo de fluorescência em tempo real para quantificação de vírus e genotipagem de SNP, precisamos de uma máquina de PCR com a maior especificidade possível;se for detecção de patógenos e mRNA, precisamos de alta sensibilidade Máquina PCR, então como devemos otimizar esta máquina de PCR?

Aqui está a lista de conteúdo:

l Melhorando a eficiência da amplificação da máquina PCR

l Usando primers de máquina de PCR em tempo real para PCR geral

Melhorando a eficiência da amplificação da máquina PCR

Melhorar a máquina PCR eficiência de amplificação, especificidade e sensibilidade, podemos otimizar a máquina de PCR quantitativa de fluorescência em tempo real para o experimento por meio de uma série de medidas.A primeira é a seleção da sequência alvo.

1, a escolha do comprimento apropriado da sequência alvo da máquina de PCR em tempo real conveniente entre 50 a 150 pb.Sequências mais curtas levam menos tempo para serem sintetizadas e têm tempos de amplificação mais curtos, de modo que a possibilidade de contaminação do DNA sendo amplificado é reduzida.

2, Ao selecionar a sequência alvo, use a pesquisa BLAST para analisar a sequência alvo em busca de polimorfismos e erros de sequenciamento e evitá-los.Se houver sequências duplicadas na sequência alvo, isso reduzirá a sensibilidade de detecção desta máquina de PCR e também deverá ser evitado.

3, controle o conteúdo de GC ≤ 60% na sequência alvo.Alto conteúdo de GC afetará a desnaturação da sequência alvo no ciclo térmico, mas também será fácil de produzir amplificação não específica desta máquina de PCR.

4, evite gerar estrutura secundária.As sequências alvo com sequências repetitivas reversas são fáceis de produzir estrutura secundária, o que afeta a hibridização de primers e sondas convenientes para máquinas de PCR em tempo real.

Além disso, também precisamos garantir que a qualidade do modelo não afetará a amplificação, e que os resultados da conveniente máquina de PCR em tempo real sejam confiáveis.Por exemplo, o ADN danificado não pode ser amplificado adequadamente na máquina de PCR ou nem sequer é amplificado.Além disso, a presença de reagentes inibidores da DNA polimerase (DMSO, etc.) e contaminantes (SDS, etc.) no modelo pode afetar a confiabilidade dos resultados de amplificação da máquina de PCR.

Usando primers de máquina de PCR em tempo real para PCR geral

Obtenha conveniência em tempo real Máquina PCR primers, este método também pode ser usado para PCR comum.

1, o comprimento deve ser de 18-30pb para garantir a especificidade da ligação.

2, A temperatura de fusão (valor Tm) deve ser de 55-60°C, e os valores de Tm dos dois primers devem diferir em 2-3°C.

3, Cada primer deve ter 1 a 3 guaninas ou citosinas na extremidade 3', o que pode reduzir convenientemente a amplificação não específica durante a máquina de PCR em tempo real.Mais de 3 resultarão em tiro pela culatra e causarão um 'efeito deslizante' levando à extensão errada.

4. O conteúdo de GC dos primers deve ser em torno de 50%; um conteúdo de GC muito alto aumentará o valor de Tm.

5, os primers da máquina de PCR devem evitar sequências repetitivas reversas, pois formarão uma estrutura secundária, afetando a ligação do primer ao molde.

6, Se for RT-PCR, você também precisa evitar projetar primers para se ligarem às sequências de exon, o que levará a resultados experimentais da máquina de PCR falso-positivos.A abordagem correta deve ser projetada no flanco longo do íntron, ou íntrons curtos, ou através da região de junção éxon-éxon.

7. Dessalinização e purificação dos primers.

Observe que às vezes, depois de ter feito todos os pontos, os primers podem não amplificar, então você deve redesenhar os primers.

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